猪细胞巨化病毒性感染

    猪细胞巨化病毒感染是猪细胞巨化病毒引起仔猪一种常见传染病。在易感猪群中可引起胚胎死亡和仔猪鼻炎、肺炎及生长发育不良、增重差等临床症状。Done(1955)在猪鼻甲骨黏膜黏液腺中巨细胞中发现有大量嗜碱性核内包涵体，首次从英格兰分离获得疱疹样病毒粒子；这是继伪狂犬病病毒之后发现的第二个猪的疱疹病毒。因患猪临床上以鼻炎为特征，并在感染的鼻甲骨黏膜黏液腺中巨细胞可见到大量嗜碱性 核内包涵体，因而将 PCMV引起的这种疾病称为包涵体鼻炎。据电镜观察，病毒的性质及其所致病变与人的细胞巨化病毒和豚鼠的唾液腺病毒类似，而本病毒的感染动物的范围仅限于猪 ， 故又将该病毒称为猪细胞巨化病毒 (PCMV)。本病毒分布相当广泛。从近年的报道看，常规条件下饲养的大多数猪群均存在PCMV感染，PCMV抗体阳性率都很高，但大多数为亚临床型，临床发病则很少见。欧洲很多国家都发现有本 病。德国用 PCR方法，调查猪的流行率要高于50%。在英国进行的血清学检查的结果表明：90%以上的猪群曾受到过感染，通过ELISA或IFA检测，发现98%以上的猪血清呈阳性。在日本自 1972年就有本病病理学方面的报道，1981年6～11月，对441例肥育猪血清用间接荧光抗体法 做了抗体调查，有 434例(98.4%)为阳性。用ELISA所作的调查，436份样品有433份(99.4% )为强阳性，并于1985年首次分离到病毒。北美和澳大利亚也有报道，其中美 国发病率甚高，猪群的抗体保有率为 90%。说明凡饲养猪只的地区，都可能有本病毒的感染 。1 病原学1.1 形态结构     PCMV属于疱疹病毒科，β疱疹病毒亚科、巨细胞病毒属的成员；近来有人认为将本病毒划在玫瑰疹病毒属中更为恰当［3］?。PCMV在形态上属于典型的疱疹病 毒，中央为电子致密的芯髓，芯髓常为卵圆形、也有长方形到哑铃状，其直径为 45～70 nm 。在芯髓外围为正十二面体核衣壳，其直径约 80～100 nm，最外围为囊膜，多为单层，偶尔 也有双层，有囊膜的病毒颗粒直径为 120～150 nm。囊膜上还有纤突。核衣壳与囊膜之间似 乎有一圈半透明带包围着电子致密外套相分隔 。 感染病毒后的细胞体积极度增大，可达正常细胞的 6倍，线粒体、内质网和高尔基体也出现 肿胀，超薄切片可见巨大的核内包涵体，常呈结晶体样排列。在病毒复制后期的细胞裂解过 程中，在细胞浆中也可看到晶体样排列的病毒。与所见到的其他疱疹病毒中一样，也常常见 到没有芯髓或无囊膜仅有核衣壳的病毒粒子。    最近日本学者 Goltz等(2000)采用PCR方法扩增了PCMV的DNA聚合酶基因，并进行测序 。对德国株的DNA聚合酶(DPOL)位点进行了扩增，测定了2个完整开放性阅读框(ORF)及 包括完全 DPOL基因和糖蛋白gB 3′端的2个部分ORF序列。推导的氨基酸序列与β?疱疹病 毒的各个蛋白有很高的同源性，特别是与人疱疹病毒 6型和7型的ORF?36～39同源性更高 。与 日本株、西班牙株、英国株的 DPOL基因比较，仅有0.4%～1%的差异。对PCMV的主要衣壳蛋白 (MCP)基因也得以鉴定。序列分析表明，PCMV的MCP基因全长4026个核苷酸，编 码 1 341个氨基酸的蛋白，据预计MCP的分子量为151，456 Da，系统发育分析认为，PCMV与 人疱疹病毒6型或7型的同源性高于与人或鼠细胞巨化病毒的同源性。人工感染PCMV的血清不 能与细菌表达的 MCP反应，表明POMV的MCP可能与感染后体液免疫应答无关。1.2 病毒培养     PCMV在体外增殖有一定难度，用猪的肾或睾丸原代细胞、末梢血液中的巨噬细胞以及猪肾细胞系培养，均不能增殖，但直接用已感染了病毒的猪肾或睾丸，作细胞带 毒培养，病毒则可充分增殖，并出现细胞病变。在原代细胞中只有 3～5周龄仔猪的肺泡巨噬 细胞最适宜于病毒的首次分离和连续传代。 PCMV在猪肺泡巨噬细胞培养物上增殖很慢，接种 后 3～14天才可看到巨细胞形成和核内包涵体，偶尔还可见细胞浆内包涵体，但其大小比核 内包涵体要小。在接种 11～14天后，PCMV的最高滴度可达5.5TCID50/ml。然而，肺泡 巨噬细胞自身不能繁殖，因此，必须用原代细胞培养物进行病毒的传代。由于肺泡巨噬细胞 经常受到包括PCMV和PRRSV在内的病毒污染，故在细胞使用之前要对这些病毒进行监测，确保安全可靠、无污染。较可靠的办法是使用无菌猪或SPF猪肺泡巨噬细胞。据 Kawamura H等报道，猪输卵管细胞可支持该病毒复制，Bouillant等建立了输 卵管类上皮和输卵管类成纤维细胞，可以用于病毒培养。其细胞病变不明显，必须用姬姆萨 染色或标记抗体染色后观察。另有报道，十四烷酰佛波醇乙酸酯 (120tertadecanoylpho rbol 13?acetate)能增强病毒的复制。1.3 抗原特性     有关猪包涵体鼻炎病毒抗原特性的研究很少，迄今为止 ，仅对世界不同国家的  7个PCMV分离物的ELISA特性进行了比较，发现OF1株在血清学上与Chiba2和Hiroshima株 有明显不同。同时 Chiba2株与Chiba C株之间、Chiba C株与Kagawa S株之间也有不同，而英 国的 B6株与OF2、Chiba2、Chiba C和Hiroshima等株也表现有血清学差异。以上 资料表明 PCMV不同地区分离株之间可能存在抗原结构的差异。本病毒的抗原特异性较强，与 其他疱疹病毒尚未发现有交叉反应。?1.4 抵抗力     该病毒在56℃经30 min灭活。22℃只能保持24 h活性。但将患病仔猪鼻黏膜组织保存于 -30℃，其感染力至少可维持5个月，病毒液在-60℃下可保存2年以上。 PCMV对有机溶剂(如氯仿和乙醚)敏感，经过这些试剂处理，可使其丧失感染力 。 ?2 流行病学?PCMV在体内外有高度的宿主特异性，仅猪感染，尚未发现其他实验动物感染的报道，例如兔、小鼠、苍鼠、鸡胚和牛均不感染。PCMV最易传染和扩散的途径是上呼吸道。通常认为1个月龄左右的猪是经鼻感染的，仔猪可 能主要是通过与母猪接触而感染。病毒可由鼻、眼分泌物及子宫颈黏液等排出尿液也会加 大环境污染。可能经飞沫和吮乳途径在猪群中呈水平传播。本病毒还可通过胎盘传播，垂直 感染胎儿，从初次感染 PCMV怀孕母猪的眼、鼻分泌液、尿液和子宫颈黏液中都可以分离出病 毒。也可从公猪的睾丸和附睾中分离出该病毒，所以通过交配也能发生传染。与其他细胞巨化病毒一样，PCMV主要是一种“机会性感染”的病毒，用不排毒的5～6月龄猪 的肺泡巨噬细胞进行培养，几乎可 100%地分离出PCMV。根据病毒能持续感染肺泡巨噬细胞这一事实，推测该病毒可能具有免疫抑制作用。实际上在长途运输、寒冷、分娩等应激因素作用下或使用类皮质激素后，处于潜伏感染状态的猪只，病毒可被激活并重新排毒。3 临床症状?潜伏期14～21天。临床症状随年龄和生理状态不同，有很大差异。 无论在实验室还是在野外条件下 PCMV可引起木乃伊、死产和新生仔猪死亡，以仔猪鼻炎、 肺炎与生长发育不良。感染率随猪群而异，从 12%～90%，死亡率最高时达25%。?  妊娠母猪感染后在整个妊娠期未见有发热或其他临床异常，但在病毒血症阶段常常会嗜眠、食欲不振，如首次感染发生于妊娠后期的母猪，则引起胚胎死亡、木乃伊胎、死产和不育等 繁殖障碍。有些仔猪出生后可能未见有临床症状即死亡，有些弱仔表现为贫血、皮肤或黏膜 苍白、不同程度的水肿、生长及发育不良 。本病常发生于1～3周龄的仔猪，发病程度与初乳中获得母源性抗体多少有关。 生后 5～10日龄仔猪感染后，呈现急性经过，其主要症状是呼吸道症状，如喷嚏、咳嗽、流泪、鼻分泌物增多，继之出现鼻塞、吮乳困难，体重很快减轻，如果无母源抗体的仔猪感染则可能发生鼻衄。严重时还可见仔猪颤抖和呼吸困难等症状。可在发病后 5天死亡，一窝 仔猪中死淘率可高达 25%，其他耐过的仔猪表现生长发育不良，增重变慢。少数病例发生鼻甲骨的萎缩和颜面变形，据称可能与混合感染有关。据野外长期观察发现， PCMV和支 气管败血波氏杆菌之间的协同作用。一些3周龄以内的猪只表现轻度的呼吸道感染的症状，病理检查时有上皮感染的广泛性损害 ，其发病率与死亡率都很低。如果无并发或继发其他感染的话， 3周龄以上的猪PCMV感染后通常表现为亚临床型。但有些初次感染的成年猪与妊娠母猪相似，体温也不高，但在病毒血 症阶段会出现嗜眠、食欲不振，并产生全身性感染的损害。    3月龄以上的猪感染无明显的症 状。康复猪常成为隐性感染，长期排毒，这些存活猪都是危险的传染源。?4 病理变化?大体病变     病猪的主要病变在上呼吸道，鼻黏膜表面附有卡他性?脓性分泌物，深部黏膜因细胞聚集而形成灰白色小病灶。此外常见全身的瘀点和水肿，尤其是肺、胸腔、喉头及跗关节皮下组织。肺小叶间隔因渗出液充盈而增宽，尖叶、心叶和膈叶的顶端实变，呈紫红色。肾由于广泛瘀点和水肿，而外观呈斑点状或完全发紫、发黑。全身淋巴结肿大并有瘀点，偶 尔在小肠也可见出血，病变从短于 1 cm的区域至全肠段不等。   胎儿感染无肉眼可见的特征性病变。病理组织学     较大猪中上皮组织的广泛性感染与胎儿或新生仔猪的网状内皮组织全身性感染是不同的。在较大猪的鼻黏膜腺、副泪腺及泪腺的腺泡和导管上皮、肾小管上皮中，可见到特征性的嗜碱性核内包涵体及巨细胞，在这些组织中可能有大量的细胞被感染。在食管的黏膜腺、附睾管、输精管、十二指肠和空肠黏膜的上皮细胞中也见到少量的包涵体。在这些病变部位，淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞浸润于感染的上皮组织周围，并侵入腺泡。在腺泡损伤处，由导管增生的鳞状上皮取而代之，在鼻甲骨黏膜中有局灶性淋巴组织增生。肾表现为间质性肾炎的病变。在中枢神经系统可见到稀少的局灶性胶质细胞增生，有 时在胶质细胞中可看到包涵体。     在引起胎儿感染的急性致死性综合征中，包涵体多见于毛细血管内皮细胞和窦状隙细胞中，故在所有淋巴和实质组织中均可发现包涵体。上皮损伤造成局部水肿、出血，巨噬细胞和红细胞渗出到扩张的细胞外间隙中。在血管和脾脏可见到含有包涵体的单核细胞，肺泡组织中则以感染的巨噬细胞为主。在肝细胞内的病毒复制造成肝脏局灶性坏死，在肾脏，包涵体多见于分化的肾组织和肾小球毛细血管内皮。出血和胶质细胞增生遍及整个中枢神经系统，尤其是在脉络丛、小脑和嗅叶。野外暴发时，由于并发感染而使病变更为复杂化。据报道，这 些感染有黏液性?化脓性鼻炎、肺炎和肠炎等。?5 实验室诊断?呈现传染性鼻炎症状的仔猪，特别是1～3周龄的患鼻炎病猪，要考虑到发生本病的可能性。 对表现出类似SMEDI综合征的繁殖障碍母猪，必须同细小病毒、猪腺病毒以及伪狂犬病毒感染猪做出鉴别诊断。本病毒感染在上皮细胞内形成巨大的嗜碱性核内包涵体和不引起流产， 与上述疾病有不同之处。5.1 病毒分离与鉴定     怀疑猪群中是否有PCMV感染，可采集胎儿或新生仔猪的鼻汁，或鼻腔、喉头、结膜等拭子以及肺、肾、淋巴结等材料，接种肺泡巨噬细胞或输卵管类成纤维细胞，进行病毒分离，也可以用肺泡巨噬细胞直接培养分离病毒。接种病料后培养 7～14天， 观察细胞病变。 用荧光抗体染色检查细胞核内包涵体出现情况，或检查细胞浆内的荧光抗原。如用已知标准毒株的免疫血清，以标准的病毒培养物为对照，对分离毒株进行中和试验，可对病毒分离物予以鉴定。病毒的形态观察和理化学特性检查，也有一定参考价值 。电镜检查在感染的细胞核和细胞浆内(主要为空泡内)能发现结晶状排列的病毒。 5.2 组织病理学检查     对于全身感染的病猪，可采取鼻黏膜或其刮削物作组织染色标本检查，根据在鼻黏膜管状腺见到特征性成丛的膨大细胞及嗜碱性核内“鹰眼形”包涵体，不难作出诊断 。也可根据组织切片中的嗜碱性核内包涵体和巨细胞检查，或作冰冻切片，用免疫染色法检测病毒抗原，继而作出诊断。在急性感染的幼龄仔猪肾和脑等组织， 也可见到这种包涵体。5.3 血清学试验 血清抗体是确证猪群中存在PCMV最可信的方法，本法也可以用于对剖腹产猪进行监测。对育肥猪随机采取血清样品做间接免疫荧光试验或者 ELISA试验测定，将感 染病毒的肺泡巨噬细胞或类成纤维细胞用丙酮固定，然后进行间接荧光抗体染色法检查，其试验敏感性比病毒中和试验至少高 8倍，而且还可对不同类别的IgG和IgM抗体予以鉴别。人 工感染后 3周可检出抗体，6周后达最高值并一直持续到屠宰。现场猪的抗体效价多为64～12 8倍。也可应用感染的输卵管类上皮细胞作ELISA，它与间接荧光抗体具有相同的敏感性。现场猪 在 2～3周龄感染病毒，血清抗体在5～6周龄转阳，并呈终生持续感染。Tajima等(1994)以血 纸法建立了ELISA法，并将全血法与血清检法的抗体效价进行了比较，样品的吸收值高度相 关(r=0.88)，对26份田间收集血纸的检查，发现这些仔猪出生后8周母源抗体水平下降，并 从 4头猪中检出IgM抗体。 PCR技术 Hamel等(1999)首次报道了应用PCR诊断本病，采用直接从具有不同临床综合征的病猪肺和鼻黏膜的刮削物提取 DNA检查的方法，从126份样品中检出59份阳性样品，该方法有 可能成为PCMV检查和监测的常规方法。之后，Fryer等(2001)用定量竞争PCR对 不同的猪器官(包括用于异种移植供体)进行了病毒的检测，可以从每微克DNA中检出低于10 至 97个基因组拷贝。?6 防制措施?康复猪血清中虽产生相当水平的中和抗体，但不能清除体内的病毒，表明本病的免疫力不强。患病母猪的初乳内含有中和抗体，可为哺乳仔猪提供一定的保护力。但是在PCMV呈地方性 流行的猪场，似乎只有存在循环的母源抗体时才向外排毒。迄今尚未见有疫苗研制的报道。目前对此病无治疗方法，但在发生鼻炎时，可使用抗菌类药 物控制细菌的继发感染。在猪群饲养管理良好时，在有与 PCMV有关的鼻炎和/或SMEDI的地方 ，疾病的暴发通常具有自限性。因此要加强饲养管理，尤其是 PCMV呈地方性流行的猪群中，引种前要进行隔离和免疫检测，防止将传染源引入易感猪群中，导致本病暴发或激发原有猪群的潜伏感染。理想的控制措施是通过剖腹产取得猪崽隔离饲养，并进行至少 70天的血清学 监测，以建立无病毒感染的猪群。?   近年来猪PRRS的广泛传播，给养猪生产造成了巨大的经济损失，诊断RRSV的实验工作也在各 地普遍展开，目前在某些病例中，偶尔也会在初次分离 PRRSV的猪肺巨噬细胞中发现PCMV。从无症状猪的肺泡巨噬细胞中发现病毒，说明巨噬细胞是感染源。 PCMV能够抑制宿主的免疫 功能和防御机制，尤其是抑制T?细胞的功能，从而影响到感染的后果。相信随着时间的推 移，本病的重要性同 PRRS一样，势必会引起人们的关注。PCMV将会得到人们更广泛地认识。    胞中可看到包涵体。     在引起胎儿感染的急性致死性综合征中，包涵体多见于毛细血管内皮细胞和窦状隙细胞中，故在所有淋巴和实质组织中均可发现包涵体。上皮损伤造成局部水肿、出血，巨噬细胞和红细胞渗出到扩张的细胞外间隙中。在血管和脾脏可见到含有包涵体的单核细胞，肺泡组织中则以感染的巨噬细胞为主。在肝细胞内的病毒复制造成肝脏局灶性坏死，在肾脏，包涵体多见于分化的肾组织和肾小球毛细血管内皮。出血和胶质细胞增生遍及整个中枢神经系统，尤其是在脉络丛、小脑和嗅叶。野外暴发时，由于并发感染而使病变更为复杂化。据报道，这 些感染有黏液性?化脓性鼻炎、肺炎和肠炎等。?