猪链球菌的实验室分离与鉴定

    猪链球菌病（Swine Streptococcosis）是危害养猪业的一种常见传染病。在我国，对猪危害最严重的以C群兽疫链球菌为主，其次是D群，L群、S群和R群也可引起，E群主要引起关节炎和淋巴结脓肿。猪链球菌病在临床上可分为败血症型、脑膜炎型、关节炎型、淋巴结脓肿型等。哺乳仔猪和刚断乳仔猪发病主要以败血症型、脑膜炎型为主，发病率和死亡率均较高。肥育猪发病多以关节炎或淋巴结脓肿为特征，其死亡率较低，但影响生长发育。    2005年12月，郑州南郊某猪场仔猪流行关节炎及败血症，多为2～6周龄仔猪;病猪精神不振，食欲减少或废绝，体温40.0℃～41.5℃，呈稽留热，眼结膜潮红，眼睑稍水肿;多数病猪呼吸迫促;部分仔猪有关节炎症状，关节肿胀、疼痛、后肢不能站立;个别猪突然发病，出现神经症状;病死猪腹侧皮肤及皮下瘀血，血液呈暗红色，凝固不良，肺呈红色，体积增大，切面有大量的红色泡沫，脾、肝局部瘀血、肿胀，呈暗红色，肠系膜淋巴结肿大，胃底部出血，四肢关节腔滑液多且浑浊。    根据临床及剖检，初步诊断为猪链球菌病，并无菌采取关节炎病猪的关节液及败血症病猪的肝、脾、肺及肠系膜淋巴结，经实验室分离鉴定，证实为猪链球菌。现将分离鉴定结果报告如下。    1 试验材料    1.1 病料 无菌采患关节炎病猪的关节液，无菌采集急性死亡的病猪心血、肝、肺、脾及肠系膜淋巴结等病料。    1.2 试剂 染色液、常规试剂自行配制。    1.3 培养基 生化实验用培养基、营养肉汤培养基、普通营养琼脂培养基和血清肉汤培养基按常规方法配制，鲜血琼脂平板由郑州牧专实验设备管理科提供。    1.4 药敏纸片 由郑州牧专实验设备管理科提供。    1.5 试验动物 健康小白鼠10只，由郑州牧专动物医药系实验动物中心提供，观察一周，健康者做动物致病性实验用。    2 方法    2.1 涂片镜检 无菌采集急性死亡的病猪心血、肝、肺、脾及肠系膜淋巴结等病料，制作肝脏、脾脏的触片，用关节液、心血涂片，干燥、火焰固定后进行革兰氏染色镜检。    2.2 细菌分离培养 无菌采集的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结、关节液等病料分别划线接种鲜血琼脂平板，37℃培养24～48小时后，观察菌落特征，选取鲜血琼脂平板上微小、圆形、边缘整齐、略带灰白色、露滴样、有明显的β型溶血环的单个菌落的小部分革兰氏染色、显微镜检查呈成对或短链状革兰氏阳性球菌后，菌落的其余部分再分别接种于普通琼脂斜面培养基、血清肉汤培养基、营养肉汤培养基，置37℃温箱内培养24～48小时，如此获得分离菌的纯培养物及在不同培养基上的生长情况。    2.3 培养特性检查 观察其在不同培养基上的生长情况，并涂片、染色、镜检。将纯培养物接种于鲜血琼脂斜面培养基，分别置于37℃、10℃和45℃条件下培养24～48小时，观察其能否生长。    2.4 生化试验特性检查 分离菌血清肉汤培养物分别接种于各种生化培养基，37℃培养24～48小时后，观察其生化反应特性。    2.5 药敏试验 采用纸片扩散法，根据药敏试验要求的距离，用无菌棉签蘸取分离菌的肉汤培养物，涂布法接种于琼脂平板;待稍干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在培养基表面，37℃培养20～24小时，观察结果，分别测定抑菌环的直径。判定标准：抑菌环直径在15mm以上为高度敏感，10～15mm为中度敏感，10mm以下为低度敏感，无抑菌环为不敏感。    2.6 动物试验 健康小白鼠10只，随机分为2组，每组5只，其中一组无菌吸取上述肉汤培养物0.5ml/只分别腹腔注射作为实验组;另外一组5只小白鼠接种无菌生理盐水做对照。每天观察其死亡和发病情况。    3 结果    3.1 涂片镜检 革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性球菌，呈成对或短链状排列。    3.2 培养特性 37℃培养24小时后，在鲜血琼脂平板上形成半透明、表面光滑、微隆起的灰白色露珠状的小菌落，外层有明显的p溶血环，生长良好;在普通琼脂平板上菌落贫瘠，比血琼脂平板小;在血清肉汤中先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。染色镜检：革兰氏阳性球菌，固体培养基中的呈3～5个连成链排列，液体培养基中的则呈4～8个连成链排列，或者更长。鲜血琼脂斜面培养基10℃和45℃条件下培养24～48小时，均无生长，37℃生长良好。    3.3 生化试验结果 见表1。表明生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌均为猪链球菌。    表1 分离菌生化试验结果    葡萄糖 ＋ 甘露醇 ＋    山梨醇 － 杨 苷 ＋    蔗 糖 ＋ 麦牙糖 ＋    乳 糖 ＋ 菊 糖 ＋    棉实糖 － 葡萄糖 ＋    M-R试验 － 三糖铁 ＋    V-P试验 － 靛基质 －    注："＋"表示大多数菌株为阳性;"－"表示大多数菌株为阴性。    3.4 动物试验结果 5只兔子在接种后36～84小时呈现不同的症状变化，其中1只在接种后48小时左右衰竭死亡;1只在接种后72小时后衰竭死亡;另外3只表现为食欲减退、精神沉郁、颌下淋巴结肿胀。剖检可见其肝、脾、肾肿大，膀胱高度充盈，胸腔积液，心冠脂肪出血，用死鼠的心血及胸腔积液涂片，革兰氏染色镜检，发现有大量单个、成对或呈4～6个左右的短链革兰氏阳性球菌。对照组5只小鼠一切正常。    3.5 药敏试验结果 见表2。敏感的药物依次是头孢菌素、青霉素、卡那霉素，而对环丙沙星、土霉素、链霉素、庆大霉素、强力霉素、阿莫西林具有抗药性。    表2 药敏试验结果    药物名称 头孢菌素 青霉素 卡那霉素 环丙沙星 土霉素 链霉素 庆大霉素 强力霉素 阿莫西林    抑菌环直径（mm） 18 17 17 10 8 7.5 6 6 5    4 分析与讨论    根据该猪场分离菌株的形态染色特性、培养特性、生化特性及动物试验，结合临床诊断，确诊为猪链球菌病。    该试验分离到的菌株呈成对或短链排列，肉汤培养物多呈长链排列，革兰氏阳性球菌，该分离菌株对营养要求较高，在鲜血琼脂平板上生长良好，但在普通营养琼脂平板上和麦康凯琼脂平板上生长贫瘠或不生长。    药敏试验结果敏感的药物依次是头孢菌素、青霉素、卡那霉素，而对环丙沙星、土霉素、链霉素、庆大霉素、强力霉素、阿莫西林具有抗药性。猪链球菌极易产生耐药性，建议采用药敏试验筛选出的较敏感药物对该猪场发病猪进行治疗，可以起到较好的效果。    分群鉴定链球菌的方法主要是血清学试验和生化试验。其中，血清学试验比较简单可靠，但标准阳性血清不易获得;生化试验只能鉴定到群，无法进行定型鉴定。    利用本场分离菌株制备自家苗是预防猪链球菌的一种切实可行的办法，保护率高，成本低。    病猪和带菌猪是该病的重要传染源。首先应加强对健康猪的免疫，加强各个环节的管理，建立健全严格的防疫消毒制度。养猪场一旦发现病猪应迅速隔离治疗，对病死猪做无害化处理以防病原扩散，对被病猪污染的圈舍、场地、用具等进行严格消毒。