针对仔猪轮状病毒性腹泻的研究进展

仔猪轮状病毒性腹泻主要以腹泻、厌食、呕吐、脱水为特征，一旦暴发就可能连年发生，患病猪和隐性带毒猪是该病的主要传染源。Woode等在1974年首次从猪分离出轮状病毒。中国于1982年从腹泻猪粪便中分离到轮状病毒。澳大利亚、美国、英国等先后都有关于该病毒的报道，目前该病在全世界普遍存在。我国轮状病毒流行的特点是混合感染，由于饲养环境较差，人们往往认为这一时期仔猪腹泻是大肠埃希菌引发，其实轮状病毒是其发病的一个重要诱因。轮状病毒性腹泻对人类健康和畜牧业发展都有较大危害，在全球已成为一个重要的公共卫生问题。1　病原学1.1　病毒形态及分子特征轮状病毒(Rotavirus，RV)属呼肠病毒科，轮状病毒属，分为A，B，C，D和E和F6个群，在发生腹泻的动物中最常见的是A群，感染猪的RV有A群、B群、C群和E群。其中，A群称为典型RV，其他则称为非典型RV。纯化的病毒在电镜下略呈球状，具有双层衣壳，直径为65nm～75nm，20面体对称。病毒的中央为一个电子致密的六角形核心，直径37nm～40nm，即芯髓；周围有一电子透明层，壳粒由此向外呈辐射状排列，构成内衣壳；外周为一层光滑薄膜构成的外衣壳，厚约20nm。RV因其形似车轮状结构而得名。病毒颗粒在感染的粪样和细胞培养物中以两种形式存在，一种是含有完整外壳的实心光滑型颗粒，大约70nm～75nm，具有传染性；另一种是不含外壳且仅含有内壳的粗糙型颗粒，大约50nm～60nm。病毒体核心是由11个不连续的双股正链RNA片段组成，除了片段11具有2个开放阅读框外，其他的片段只有1个开放阅读框。每一片段各编码一种蛋白，包括6种结构蛋白即VP1～VP4，VP6和VP7。VP1～VP3为芯髓蛋白，VP4和VP7为外衣壳蛋白，VP6为内衣壳蛋白。在病毒侵入细胞的过程当中VP4起到关键作用，VP4经胰蛋白酶(Trypsin)裂解可产生VP5(60ku)和VP8(26ku)2个结构部分，与病毒附着、聚集有重要关系，并能提高病毒感染性。研究表明，VP7具有稳定VP4结构的作用。此外，还有5种非结构蛋白即NSP1～NSP5，其中NSP1，NSP2，NSP3，NSP5为RNA结合蛋白，与病毒的复制、合成和表达有关。NSP4是一种糖蛋白，与病毒粒子从内质网出芽有关，在病毒的复制以及致病机理方面具有重要作用。NSP4的突变可以影响病毒的毒力。1.2　病毒分型利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可将RV的11个双链RNA片段分离，所形成的11条电泳带可以分为4个区段，常见的人和动物的电泳带的排列位置为4∶2∶3∶2，统称为A群，又叫典型RV。此外，以第10和11节段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率上的差异，A群RV又分长型和短型。其他统称为非典型RV，分别为B，C，D，E，F和G群。RV属于呼肠病毒科RV属的A，B，C和E群。RV粒子表面共有3种抗原，即群抗原VP6、中和抗原VP7及血凝素抗原VP4。根据群抗原VP6可以分为不同的亚群，大多数动物的A群RV为Ⅰ亚群；VP4和VP7在病原的检测和产生中和抗体以及免疫性保护过程中具有重要意义，可根据VP4和VP7分为不同的血清型系统。根据VP4形成的血清型为P(Proteasesensitive)型，VP7形成的血清型叫G(Glycoprotein)型。RV不同血清型之间的交叉反应性较差，根据RV的分子流行病学调查发现，目前已知至少有18种P血清亚型和14个G血清亚型存在。在世界广泛流行的A组RV主要有4种G和P血清型组合――G1P8，G2P4，G3P8和G4P8。1.3　培养特性RV于1968年由美国的MebusMS等首次从犊牛粪便中分离成功，1980年，美国的Waytt将人的Wa株首次利用非洲绿猴肾原代细胞培养成功。RV在体外不易培养，需要特殊培养条件，除A型RV外，其他RV的许多毒株迄今未能适应细胞培养，A型RV分离的成功率为40%～70%。因此，只能通过感染易感动物来分离和复制病毒，培养过程需加胰蛋白酶和胰凝乳酶等处理。黄旭雯等利用CV-1细胞增殖培养RV时发现，同时添加40mL/L的鸡血清和10μg/mL胰蛋白酶有利于RV的复制。此外，RV感染细胞具有特定的趋向性，在体内只感染肠绒毛上皮细胞，在体外尽管可以吸附许多细胞，但是只感染肾或肠道上皮细胞来源的细胞。培养RV常用的细胞系为MA-104、AGMK、CV-1、MARC-145等，但最适合用MA-104培养。1.4　稳定性RV对理化因素的作用有较强的抵抗力，粪便和乳汁中的病毒在18℃～20℃室温中经7个月仍有感染性，而蛋白水解酶如胰凝乳蛋白酶，能增强RV的感染性。耐乙醚、氯仿、去氧胆酸钠、次氯酸盐和脂溶剂，对酸稳定，pH3.5～10.0范围内病毒保持感染力。经反复冻融，超声波处理，以及37℃下1h仍不失活。但EDTA，EGTA等促溶剂及CaCl2、硫氯酸钾等可使双衣壳病毒粒子变为单衣壳病毒粒子，使芯髓部分的密度发生改变，病毒聚合酶的活性丧失而失去感染力。另外0.1g/L碘、10g/L次氯酸钠、700mL/L酒精、臭氧、酚等可灭活病毒。2　仔猪轮状病毒性腹泻的流行现状轮状病毒感染(Rotavirusinfection)主要是多种幼龄动物(包括仔猪、犊、羔、驹、犬及家禽在内)的一种急性肠道传染病。各种动物的RV都对各自的幼龄动物呈现明显的致病性，一旦发病后可能每年连续发生，病畜和隐性带毒者是本病的传染源。ElAttarL等试验结果表明，在适宜的条件下，感染某种动物的轮状病毒会因一种致病的适应轮状病毒给其他动物带来感染隐患，例如在犊牛和猪、人和猪之间。该病主要以厌食、呕吐、腹泻和脱水、体重减轻为特征，对人类健康和畜牧业发展都有较大危害。1974年Woode等在英国首次报道猪的RV后，RV在猪中的传播引起了许多国家的重视，接着澳大利亚、北爱尔兰、美国、法国等均有RV引起仔猪腹泻的报道。据报道，美国断奶仔猪感染阳性率为80%，病死率为15%；当有混合感染时，病死率更高。波兰学者Markowska-Daniel等对11个大型猪场2周龄～10周龄腹泻仔猪(断乳前发病率为8%～15%)采集1230份血清和531份粪样进行RV抗体检测及病毒分离，结果经ELISA检测有1214份血清为RV抗体阳性，169个粪样为抗原阳性。选择其中28份ELISA抗原阳性粪样用MA-104细胞系进行分毒，结果有18份(64.3%)可见到CPE反应，免疫荧光和电镜检查则均为阳性，PAGE电泳测定有22份(79%)为阳性。英国报道1周龄～4周龄仔猪的发病率超过80%，病死率10%～30%，发病猪体重急剧下降10%～20%，需半个月甚至更长时间才能回复到正常生长速度，这是该病的特征，同时也说明该病在经济上的影响更为重要。加拿大DeweyC等研究了感染猪只的A群RV与饲养规模管理时发现，饲养规模大且断奶较早的仔猪群易感染A群RV，阳性比率较高；集约化生产模式较持续流动设施条件下饲养的仔猪，其A群RV阳性感染率其前者比后者高3.4倍。英国学者Kilion研究表明，RV与致病性大肠埃希菌混和感染时，由于二者在致病过程中相互促进，所造成的危害要远远大于二者之和，而且是仔猪断奶后引发腹泻的一个重要原因。BarmanNN等[18]对位于印度Assam地区的528份猪血清样品进行了间接ELISA检测，其中RV阳性率占51.1%，高于TGEV(39.4%)和PEDV(21.2%)，约13.6%的猪只血清样品中含抗以上3种病毒的抗体。RV是猪病毒性腹泻的主要病原之一，约占10%～15%，在美国猪病毒性腹泻中由RV造成的损失仅次于TGEV，所以国外是非常重视的对RV的防制。中国自1982年从腹泻猪粪便中分离到RV，证实猪RV感染在我国普遍存在，至今已有24年[。该病可以引起仔猪的死亡，成年猪的掉膘，饲料报酬的降低，增加人工费和药费的开支等。李国平等用RV抗原酶标诊断试剂盒对福建省福州、南平等地的部分猪场进行了仔猪RV感染情况调查，结果显示10日龄至断奶仔猪的阳性率高达82.3%～91.7%。2003年冬季至2004年春季，上海一些规模化猪场的生产母猪虽然已按程序进行了猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联苗免疫，但其产下的仔猪仍发生病毒性腹泻，经诊断为猪RV感染，造成很大损失。程健频等于2002年10月对甘肃省庄浪县7个乡镇90户饲养的2100头仔猪进行了初步调查，发病仔猪1460头，发病率达69.5%，其中环境温度下降继发大肠埃希菌病死亡690头，死亡率47.8%；王玉春等1990年对国内19个省共计121个猪场做血清学调查，未发现阴性猪群。